Diagnostic bactériologique

Introduction

Buts du diagnostic bactériologique
- Identifier le ou les agent(s) pathogène(s) responsable(s) d’une infection
- Proposer une antibiothérapie adaptée
- Contrôler l’efficacité d’une antibiothérapie
- Identifier des porteurs sains
- Anticiper une infection (colonisation)

Deux approches
- Diagnostic direct +++ et diagnostic indirect +

Diagnostic direct

Définition
- Recherche de l’agent pathogène directement dans le prélévement pathologique
- Non orientée : isolement et culture sur milieux nutritifs appropriés des agents les plus probables
- Orientée par la clinique : recherche d’un agent spécifique (techniques immunologiques ou génétiques)

Prélévement
- Sa nature dépend de la localisation de l’infection

- Réalisé avant toute antibiothérapie si le but est diagnostique !


Diagnostic direct : examen microscopique

Après coloration de Gram
-
Pvts normalement stériles + morphologie bactérienne caractéristique = orientation diagnostique rapide
* exemple : LCR et méningocoque (cliché)
- Pvts plurimicrobiens
* permet d’apprécier l’état normal ou anormal de la flore commensale (cliché)
* association fuso-spirochètienne de l’angine de Vincent (cliché)

Etat frais
* tréponèmes syphilitiques au microscope à fond noir (e)

Coloration de Ziehl-Neelsen
Coloration à chaud et décoloration à l’acide-alcool
* bacilles acido-alcoolo-résistants BAAR: mycobactéries (BK, lèpre)

Recherche par techniques immunologiques
-
A l’aide d’anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques
- Techniques variées:

- Rapide, ± sensible, réservée surtout aux bactéries à culture difficile (Chlamydia, Clostridium difficile, Mycoplasmes...)

Recherche par techniques génétiques
- Hybridation simple avec sonde spécifique marquée
- Amplification d’une séquence cible par PCR (polymerase chain reaction)
- Sensible, très spécifique, coût élevé, réservée aux bactéries à culture difficile ou lente (bacille de Koch, Chlamydia, coqueluche..).

Culture

Principe
-
Isoler
les bactéries d’un prélévement et obtenir des clones permettant d’effectuer des réactions d’identification biochimiques ou antigéniques

Milieux nutritifs
-
Doivent apporter tous les éléments nécessaires au développement bactérien (C.H.O.N., vitamines, oligo-éléments...)
- Composition variable selon les exigences nutritionnelles des espèces (hydrolysats protéiques complexes, glucides, sels minéraux, sang...)
- Milieux liquides (bouillons)

- Milieux solides (géloses)

Incubation (étuve)
-
De 18 h (cas le plus courant) à 21 j (BK), à 37oC
- Atmosphère normale ou enrichie par 5% CO2 pour les bactéries aérobies strictes ou aéro-anaérobies facultatives (AAF)
- Atmosphère sans oxygène (CO2, H2, N2) pour les bactéries anaérobies strictes
- Colonies de 0,2 à 1,5 mm de diamètre
- Restrictions: bactéries non cultivables in vitro (tréponème de la syphilis, Chlamydia, agent de la maladie de Whipple...)

Identification
- Coloration de Gram à partir d'une colonie
- Réactions enzymatiques spécifiques de l’espèce (parfois jusqu’à 30 réactions): métabolisme, facteurs de virulence…
- Antigènes de surface spécifiques par agglutination d’une suspension de bactéries sur lame avec un immun-sérum

Diagnostic indirect : sérologie

Définition
- Recherche d’anticorps spécifiques chez un malade , témoins de l’infection par un agent donné

Conditions
- Temps nécessaire à l’apparition des anticorps = décalage par rapport au début de la maladie (1 à 3 semaines) = diagnostic souvent tardif
- 2 sérums prélevés à 15j d’intervalle pour montrer une ascension du titre des Ac (inverse de la plus grande dilution donnant une réaction +)

Méthodes
- ELISA, IF… avec un antigène bactérien commercialisé

Applications de la sérologie
- Bactéries non ou difficilement cultivables, infections décapitées par l’antibiothérapie, infections profondes ou chroniques...

Conclusion

Délai des résultats
- Le diagnostic bactériologique est lent (en moyenne 24 - 48h)
- Progrès à attendre des techniques génétiques (puces à ADN)

Justification de l'analyse bactériologique en ville
- Infections atypiques
- Infections sévères
- Echecs de l’antibiothérapie de première intention

A l'hôpital
- Toute infection doit être documentée bactériologiquement
- Gravité des infections + % élevé de souches résistantes aux antibiotiques